目前關(guān)于CRISPR–Cas9技術(shù)的談?wù)撘呀?jīng)演變到了利用該技術(shù)來進(jìn)行人類胚胎的編輯，但研究者表示，真正的技術(shù)革新才剛剛開始;CRISPR可以為我們帶來什么?為什么科學(xué)家們這么熱衷于該技術(shù)?因為其可以靶向作用任何基因組的特殊DNA序列，而對DNA進(jìn)行編輯僅僅是其眾多作用中的一種而已;來自波士頓兒童醫(yī)院的血液病學(xué)家DanielBauer表示，對于眾多分子生物學(xué)家而言，這種方法可以大大幫助我們來理解基因組的工作模式，CRISPR–Cas9技術(shù)可以真正幫助我們了解我們所想要知道的。

　　本文中，Nature雜志分析了5種方法，即CRISPR–Cas9技術(shù)如何幫助生物學(xué)家們來對細(xì)胞進(jìn)行編輯修飾。

　　CRISPR–Cas9系統(tǒng)中有兩種主要的成分：Cas9酶，其像分子剪刀一樣沿著DNA進(jìn)行修剪;另一個是小RNA分子，其可以指導(dǎo)修剪剪刀進(jìn)入DNA的特殊序列來制造切口，細(xì)胞的原始DNA修復(fù)系統(tǒng)就會廣泛修補(bǔ)這些缺口，但通常會產(chǎn)生一定的錯誤。2012年研究者們揭示了這些基因編輯工具如何切割人類的DNA，而其中一個小組決定采用另外一種不同的方法，而首先研究者要做的就是破碎基因剪刀。

　　來自加利福尼亞大學(xué)的研究人員JonathanWeissman表示，我們從斯坦福大學(xué)的研究者StanleyQi那里學(xué)到了如何去破碎基因剪刀，研究者StanleyQi對Cas9酶進(jìn)行了突變以便其可以在同導(dǎo)向RNA匹配的位點同DNA進(jìn)行結(jié)合，同時不對DNA進(jìn)行切割，隨后Cas9酶就會停頓并且阻斷其它蛋白的翻譯，這種攻擊系統(tǒng)就可以幫助研究者實現(xiàn)對特殊基因的關(guān)閉，同時并不改變DNA序列的結(jié)構(gòu)。

　　隨后研究人員拿走了死亡的Cas9酶，并且嘗試了一些新的事情，即將Cas9酶同另外一種可以激活基因表達(dá)的蛋白進(jìn)行結(jié)合，在進(jìn)行了一些巧妙的調(diào)整后，研究者構(gòu)建出了新型的開關(guān)基因的方法。目前很多實驗室都發(fā)表了對該方法進(jìn)行修改的相關(guān)結(jié)果，而且很多研究者都競相利用該方法加速研究進(jìn)展，其中一種最流行的應(yīng)用就是快速產(chǎn)生成百上千個不同的細(xì)胞系，每一種細(xì)胞系中都包含可以靶向作用特殊基因的不同引導(dǎo)RNA。

　　來自加州大學(xué)舊金山分校的研究者M(jìn)artinKampmann希望對每一個細(xì)胞進(jìn)行篩查來研究是否特殊基因的開啟或關(guān)閉會影響暴露于蛋白質(zhì)聚集體中的神經(jīng)元的生存情況，蛋白質(zhì)的聚集被認(rèn)為是很多神經(jīng)變性疾病發(fā)病的根源，比如阿爾茲海默氏癥;同時研究者Kampmann利用RNA干擾進(jìn)行了一項類似的篩選研究，但結(jié)果顯示該技術(shù)存在一定缺點;RNAi技術(shù)存在一定的脫靶效應(yīng)。隨后Weissman和其同事對該方法進(jìn)行了一定調(diào)整以便其依賴于長鏈引導(dǎo)RNA來發(fā)揮作用，這種RNA攜帶有可以結(jié)合不同蛋白質(zhì)的基序，而這一調(diào)整就可以幫助科學(xué)家們在同一個實驗中的三個不同位點來激活或抑制基因的表達(dá);研究者認(rèn)為該系統(tǒng)可以幫助一次進(jìn)行5個實驗，而唯一的限制就是這么多引導(dǎo)RNAs和蛋白質(zhì)如何被填入細(xì)胞中。

　　當(dāng)遺傳學(xué)家MarianneRots開始他的職業(yè)生涯時，她就想去開發(fā)新的醫(yī)學(xué)療法，于是她學(xué)習(xí)了基因療法，即可以靶向作用疾病中突變的基因，但數(shù)年后她決定更換自己的專業(yè)，Rots說道，我意識到很多疾病都是因為基因表達(dá)特性的改變而致，但我從來都沒有這么關(guān)注過其中一種基因突變，而最好的方法就是控制基因的活性，于是我將研究重點從基因組轉(zhuǎn)移到了表觀基因組上來。

　　表觀基因組是添加到DNA及DNA包裹蛋白(組蛋白)上的眾多化合物的“星座”集合，這些化合物可以控制對DNA的“訪問”，從而適時地調(diào)節(jié)基因表達(dá)所需的蛋白，而且這些表觀標(biāo)志物可以隨著時間而改變，其可以隨著有機(jī)體發(fā)育或環(huán)境改變而被添加或者移除。過去很多年里，科學(xué)界花費了很多資金來對不同人類細(xì)胞的表觀遺傳標(biāo)志物進(jìn)行分類編目，但除了可以改變特殊位點上標(biāo)志的能力外，科學(xué)家們并不能確定是否他們可以引發(fā)特定的生物學(xué)改變，CRISPR–Cas9技術(shù)似乎可以扭轉(zhuǎn)這個局面，2015年4月，杜克大學(xué)的研究者CharlesGersbach開發(fā)了一種系統(tǒng)，其可以利用破碎的分子剪刀將酶類攜帶到基因組中的特殊位點上，以此來將特殊的表觀遺傳標(biāo)志—乙?；砑拥浇M蛋白上。

　　研究小組發(fā)現(xiàn)，將乙?；砑拥胶虳NA相關(guān)的組蛋白上足以使得目標(biāo)基因的表達(dá)飆升，當(dāng)這一成果發(fā)表后，研究者Gersbach將他們所使用的酶“存放”到了Addgene公司以便其他研究者也可以利用其進(jìn)行相關(guān)研究。Gersbach預(yù)測，當(dāng)多個表觀遺傳標(biāo)記物被同時進(jìn)行操控的話或許就會使得多篇研究論文表現(xiàn)出一股協(xié)同效應(yīng)。

　　Gersbach提供的工具需要被“精煉”，而很多種酶類就可以產(chǎn)生或剔除DNA上的遺傳標(biāo)志物。研究者Rots利用鋅指蛋白探究了癌癥相關(guān)基因上表觀遺傳標(biāo)記物的新功能，如今科學(xué)家們采用CRISPR–Cas9來進(jìn)行相關(guān)工作，新型工具的使用將會帶來更廣泛的效應(yīng);人們可能會說這種關(guān)聯(lián)是偶然性的，但Rots卻說道，如果對表觀遺傳學(xué)進(jìn)行重寫或許并不會對基因表達(dá)產(chǎn)生任何影響，但如今我們卻可以很輕松對其進(jìn)行檢測，而且有很多人都相繼加入了進(jìn)來。

　　DNA上的表觀遺傳標(biāo)志物并不僅僅是被破碎的遺傳代碼，超過98%的人類基因組都不會編碼蛋白，但研究者卻認(rèn)為，這些大量的看似垃圾的DNA實際上也發(fā)揮著重要作用，而且目前研究者正在利用CRISPR–Cas9技術(shù)來研究這些垃圾DNA的奧秘。其中有些基因組編輯RNA分子，比如microRNAs和長鏈非編碼RNAs，除了制造蛋白以外，這些RNA分子被認(rèn)為還存在其它功能，而其它的序列就是可以放大基因表達(dá)的增強(qiáng)子。很多DNA序列都和常見疾病的發(fā)病風(fēng)險直接相關(guān)，這取決于包含非編碼RNA和增強(qiáng)子的特殊基因組區(qū)域，在CRISPR–Cas9技術(shù)出現(xiàn)之前，研究者很難確定到底是哪些基因組的問題，但如今卻很方便。

　　如今研究者Farnham和其同事利用CRISPR–Cas9技術(shù)剔除了在前列腺癌癌和結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)的突變的增強(qiáng)子區(qū)域，在這項成果未發(fā)表的研究中，研究人員剔除了被認(rèn)為非常關(guān)鍵的增強(qiáng)子;來自MIT的研究者DavidGifford和布萊根婦女醫(yī)院的研究者RichardSherwood就通過合作，利用CRISPR–Cas9技術(shù)在4萬個字母的序列中引發(fā)突變，隨后他們檢測了是否每一個突變都會對附近產(chǎn)生熒光蛋白的基因帶來影響，研究者將結(jié)果繪制成了一張展示增強(qiáng)基因表達(dá)的DNA序列圖譜。

　　深入研究“暗物質(zhì)”存在一定挑戰(zhàn)，而CRISPR–Cas9技術(shù)也是一樣，Cas9酶可以切割導(dǎo)向RNA的特殊位點，但僅僅是當(dāng)一種特殊但卻常見的DNA序列出現(xiàn)在切割位點附近時才會這樣;如今研究人員正在搜集細(xì)菌王國中Cas9酶的“親戚”，Cas9酶可以識別不同的序列;去年來自MIT博德研究所的研究者FengZhang就發(fā)現(xiàn)了一種名為Cpf1的酶類家族，該酶類和Cas9酶相似，這就可以擴(kuò)展這種特殊酶類識別序列的選擇;但研究者指出，目前并沒有可以替代Cas9酶的新型酶類，未來他們希望可以完整地搜集可以在基因組任意位點被靶向作用的酶類。

　　研究者Gersbach的實驗室利用基因編輯工具來幫助理解細(xì)胞命運的變化，同時研究者還揭示了如何改變細(xì)胞的命運，他們希望有一天可以在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)組織供藥物篩選和細(xì)胞療法的開發(fā);但CRISPR–Cas9技術(shù)的效應(yīng)卻是持久性的，而且研究者需要在組織中的特殊位點短暫地開啟或關(guān)閉基因的表達(dá)。

　　Gersbach及其同事就利用這種破碎可修飾的酶類Cas9(激活基因的表達(dá))及被藍(lán)光激活的添加蛋白進(jìn)行研究，這種新型系統(tǒng)就就可以在細(xì)胞暴露光下的時候誘發(fā)基因的表達(dá)，當(dāng)無光的時候就會阻斷基因的表達(dá);來自東京大學(xué)的研究者M(jìn)oritoshiSato開發(fā)了一種相似的系統(tǒng)，并且也制造出了一種可以在藍(lán)光刺激下對基因組進(jìn)行編輯的Cas9酶。

　　癌癥研究者WenXue在其博士后第一年就開始研究制造可以在某些人類肝癌中產(chǎn)生一種突變的轉(zhuǎn)基因小鼠，他埋頭苦干最終開發(fā)出了對基因靶向作用非常必要的工具，隨后將該工具注入到胚胎干細(xì)胞中，并且設(shè)法制造攜帶突變的小鼠，這項研究的花費是一年，外加2萬美金。一年之后當(dāng)他開始著手另外一種轉(zhuǎn)基因小鼠實驗時，他的導(dǎo)師讓他試試?yán)肅RISPR–Cas9技術(shù)，這次Xue僅僅利用工具對單細(xì)胞小鼠胚胎進(jìn)行研究，最后僅僅在一個月內(nèi)就獲得了想要的小鼠種類，最后WenXue的博士后生涯縮短了很長時間。

　　如今不管是研究癌癥還是研究神經(jīng)變性疾病的研究者都開始著手利用CRISPR–Cas9來制造用于疾病研究的動物模型，該技術(shù)可以幫助科學(xué)家以多種復(fù)雜的方式制造出多種模式動物，而研究者Xue就是其一種一位，他利用該技術(shù)在培養(yǎng)基和動物體內(nèi)的細(xì)胞中對疾病突變模型進(jìn)行了研究。研究者希望混合并且配對新型的CRISPR–Cas9技術(shù)來更加精準(zhǔn)地操控動物模型的基因組及表觀基因組，這將可以幫助研究人員更加深入地理解常見人類疾病的復(fù)雜性及發(fā)病機(jī)制。

　　就拿腫瘤來講，其擁有許多可以促進(jìn)癌癥發(fā)生的突變，研究者Dow說道，然而他們對于制造腫瘤去并不是最重要的，但很明確的是我們需要兩個或三個、甚至四個突變來真正地模擬惡性疾病，并且更加深入地模擬人類癌癥;將所有這些突變以老式的方法引入小鼠中或許花費非常昂貴而且耗時。

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　　研究人員PatrickHsu2015年在索爾克研究所開始自己的研究工作，他的目的就是利用基因編輯技術(shù)在細(xì)胞培養(yǎng)液或絨猴中模擬神經(jīng)變性疾病的相關(guān)情況，比如阿爾茲海默氏癥和帕金森疾病等，相比小鼠模型而言這種方式可以更加精確地反應(yīng)人類疾病的進(jìn)展，但這在CRISPR–Cas9技術(shù)出現(xiàn)之前卻是非常昂貴而且緩慢的。

　　正巧當(dāng)研究者PatrickHsu設(shè)計出了新型的實驗方法來遺傳性地對其首個CRISPR–Cas9絨猴進(jìn)行工程化操作，他表示，這種方法或許是通往下一步研究的奠基石，很多技術(shù)轉(zhuǎn)瞬即逝，而我們總是應(yīng)該需要考慮需要解決的生物本源問題。未來新型CRISPR基因編輯技術(shù)的發(fā)展或?qū)⒋蠓殴獠省?/p>